高效液相色譜（HPLC）操作必看！

八大常見(jiàn)基礎(chǔ)問(wèn)題+解決方案

做HPLC時(shí)，你是否也遇到過(guò)流動(dòng)相走空、基線亂飄、壓力異常？一篇推文總結(jié)關(guān)鍵問(wèn)題，助你實(shí)驗(yàn)順利！

① 流動(dòng)相未過(guò)濾 → 堵柱警告！

△ 問(wèn)題：未過(guò)濾的顆粒物（如灰塵、鹽結(jié)晶）堵塞色譜柱入口篩板，導(dǎo)致柱壓升高、柱效降低、峰形拖尾或分叉。同時(shí)顆粒物進(jìn)入泵頭，磨損活塞密封圈，引發(fā)漏液或壓力不穩(wěn)，縮短泵壽命。

? 解決：

1、所有流動(dòng)相用0.45 μm濾膜過(guò)濾（水相/緩沖鹽用0.22 μm）。

2、水相緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用，冷藏防菌。

② 樣品不過(guò)濾 → 柱子當(dāng)場(chǎng)罷工

△ 問(wèn)題：顆粒堵柱，峰分裂變寬。

? 解決：

1、樣品必須過(guò) 0.22 μm濾膜。

2、控制進(jìn)樣量，別貪多。

③ 壓力飆升/波動(dòng) → 哪里堵了？

△ 原因：高壓：管路或柱堵塞；波動(dòng)：氣泡或泵故障。

? 解決：

1、高壓：檢查濾頭(拆下用水進(jìn)行超聲)→管路(更換管路)→色譜柱(反向沖洗或換篩板)。

2、波動(dòng)：流動(dòng)相使用前要進(jìn)行超聲消泡，接通儀器后打開(kāi)purge閥消除氣泡，若問(wèn)題還未解決則要進(jìn)一步檢查泵密封圈和比例閥。

④ 緩沖鹽結(jié)晶 → 管路殺手！

△ 問(wèn)題：鹽結(jié)晶堵塞管路、泵或色譜柱，引發(fā)高壓或流速異常；鹽顆粒堆積破壞固定相，導(dǎo)致峰形拖尾或保留時(shí)間漂移；結(jié)晶物進(jìn)入檢測(cè)器，基線噪音增大或出現(xiàn)假峰。 

? 解決：

1、高鹽流動(dòng)相后，先用低有機(jī)相（5-10%）沖洗30分鐘。 

2、避免鹽與高有機(jī)相直接混合，流動(dòng)相現(xiàn)配現(xiàn)用并過(guò)濾（0.22 μm）。 

3、長(zhǎng)期停用前用純水徹底沖洗系統(tǒng)，再純有機(jī)相保存。

⑤ 流動(dòng)相走空 → 泵抽空危機(jī)！

△ 問(wèn)題：氣泡進(jìn)泵，會(huì)導(dǎo)致壓力不穩(wěn)甚至磨損柱塞、缸體或密封圈，最終產(chǎn)生漏液。

? 解決：

1、設(shè)置最低壓力限報(bào)警。

2、留心關(guān)注流動(dòng)相余量，勤補(bǔ)液。

3、抽空后：用異丙醇低流速（0.5 mL/min）排氣泡。

⑥ 漏液 → 數(shù)據(jù)全崩！

△ 原因：接頭松、密封圈老化導(dǎo)致漏液。

? 解決：

1、定期檢查管路和泵頭。

2、漏液立馬停機(jī)，檢查是否需要更換PEEK管或密封圈。

⑦ 保留時(shí)間漂移 → 重復(fù)性翻車

△ 原因：溶劑揮發(fā)或配比誤差導(dǎo)致流動(dòng)相比例變化；環(huán)境溫度變化或溫控失效影響分離效率；固定相流失或污染導(dǎo)致柱效下降；泵故障或比例閥誤差引起流速波動(dòng)；樣品過(guò)載或污染改變保留行為。 

? 解決：

1、柱溫箱控溫，流動(dòng)相現(xiàn)配現(xiàn)用防揮發(fā)。  

2、用高比例有機(jī)溶劑沖洗或換新柱。 

3、校準(zhǔn)流速，維護(hù)比例閥和密封圈。 

5、用0.22 μm濾膜過(guò)濾樣品，控制進(jìn)樣量。 

⑧ 梯度洗脫基線飄 → 溶劑背鍋？

△ 原因：流動(dòng)相未脫氣；溶劑混合不均；溫度波動(dòng)；氘燈老化；流通池污染導(dǎo)致信號(hào)不穩(wěn)；梯度結(jié)束后未充分平衡，流動(dòng)相殘留擾動(dòng)基線。

? 解決：

1、使用在線脫氣機(jī)或超聲脫氣30分鐘。 

2、梯度前預(yù)混流動(dòng)相，確保均勻性。 

3、開(kāi)啟柱溫箱，維持恒溫（±1℃內(nèi)）。 

4、更換氘燈，定期清洗流通池。 

5、梯度后用初始比例沖洗5-10倍柱體積再進(jìn)樣。

記住：HPLC是細(xì)節(jié)控！

過(guò)濾、脫氣、慢切換、勤維護(hù)，數(shù)據(jù)穩(wěn)如狗！轉(zhuǎn)發(fā)給實(shí)驗(yàn)室戰(zhàn)友，一起避坑！

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